【檢驗原理】
本試劑盒針對小反芻獸疫病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,在反應體系中含小反芻獸疫病毒基因組模板的情況下,PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | PPRV RT-PCR反應液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
2 | PPRV 混合酶液 | 62.5 μL×1管 | 125 μL×1管 |
3 | PPRV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | PPRV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注:陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,陽性對照為失去活性的小反芻獸疫病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反復凍融,有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1. 適用標本類型:發(fā)病動物血液、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液。
2. 標本采集,方法如下:
(1) 血清:用一次性注射器取靜脈血2-3ml,轉至5ml 的干燥管中,密閉送檢。
(2) 腸內容物:無菌條件下取腸道內容物約1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中,立即送檢。
(3) 組織臟器:取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g,置一1.5ml的潔凈離心管中,密閉送檢。
3.應避免標本間交叉污染。
4.標本收集后可立即檢測;若不能立即檢測,可置于2~8℃冷藏過夜保存;如需長期保存,標本應凍存于-80℃以下,避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備(試劑準備區(qū))
(1)從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
(2)核算當次實驗所需要的反應數(n),并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(1T)+陽性對照數(1T)+誤差預留量(1T)+樣本數
單反液配制表 | RT-PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶液 | 2.5 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備(樣本處理區(qū))
用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,終體積為25 μl/管,蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,轉移到PCR儀器上。
4. PCR(PCR擴增區(qū))
(1)取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,并記錄放置順序。
(2)按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集小反芻獸疫病毒熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
反轉錄 | 50℃:10分鐘(min) | 1 | |
預變性 | 95℃:3分鐘(min) | 1 | |
PCR擴增 | 95℃:5秒(s) | 40 | |
55℃:40秒(s) (此階段結束時采集熒光信號) |
注:ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,設置淬滅基團選擇None。
【參考值(參考范圍)】
1.試劑盒有效性判定:
(1)陽性對照:有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
(2)陰性對照:Ct值>38或無Ct值,線形為直線或輕微斜線,無指數增長期。
2.標本結果判定:
(1)陽性:標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期。
(2)可疑:標本檢測結果Ct值在35~38范圍內。此時應對標本進行重復檢測,如重復實驗結果Ct值仍在35~38范圍內,有明顯指數增長期,則判定為陽性,否則為陰性。
(3)陰性:標本檢測結果Ct值>38或無Ct值。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM | |
陽性(+) | 標本中檢出小反芻獸疫病毒RNA |
陰性(-) | 標本中未檢出小反芻獸疫病毒RNA |
郵箱:2450868877@qq.com
傳真:86-區(qū)號-傳真號碼
地址:上海市楊浦區(qū)鐵嶺路32號1519-10室